Un'assorbanza di due significa che passa l'uno per cento della luce

Diluisci finché il numero cade fra 0,1 e 1

Ad A = 3 il rivelatore confronta un fascio con un millesimo di sé stesso, e ogni luce parassita, ogni graffio sulla cuvetta e ogni granello di polvere pesano su ciò che resta più del campione stesso. Ad A = 0,05 compare il problema opposto: la differenza fra campione e bianco è minore della deriva propria dello strumento. La banda utile in mezzo è dove uno spettrofotometro si guadagna lo stipendio, e entrarci è questione di scegliere la diluizione o la cuvetta — un cammino di 1 mm invece di 10 divide la lettura per dieci senza toccare il campione, il rimedio più rapido quando il materiale scarseggia.

L'assorbività appartiene a un composto, a una lunghezza d'onda

Non è una proprietà della macchina né della cuvetta: è un numero per una sostanza, misurato a una lunghezza d'onda, in un solvente, e muovere uno qualsiasi dei tre lo cambia. Citare un'assorbività senza la lunghezza d'onda è come citare una velocità senza direzione — la cifra è reale e la frase è incompleta. È anche per questo che uno spettrofotometro si imposta su una lunghezza d'onda precisa prima di misurare qualsiasi cosa, di norma il massimo di assorbimento del composto, dove la lettura è più grande e meno sensibile a un lieve disallineamento dello strumento. Uno spostamento di pochi nanometri vicino a un fianco ripido dello spettro può muovere la risposta più di tutto l'errore di diluizione.

Domande frequenti

A cosa serve davvero il bianco?

A sottrarre tutto ciò che non è la cosa che stai misurando. Il solvente assorbe un poco, le pareti della cuvetta riflettono un poco, e la lampada non brilla ugualmente a ogni lunghezza d'onda; azzerare su una cuvetta con tutto tranne l'analita rimuove le tre cose in un colpo. Un bianco fatto con un altro lotto di solvente, o passato in una cuvetta diversa da quella del campione, reintroduce in silenzio ciò che doveva togliere — ed è per questo che esistono cuvette appaiate e che il bianco si rimisura a ogni cambio di lunghezza d'onda.

Perché la legge cade ad alta concentrazione?

Per due ragioni insieme, una strumentale e una chimica. Quella strumentale è la luce parassita, che pone un tetto a ogni lettura: appena la trasmissione vera scende sotto la luce che filtra attorno al campione, aumentare la concentrazione non cambia più nulla. Quella chimica è che molecole affollate smettono di comportarsi in modo indipendente — interagiscono, si associano, si spostano a vicenda l'assorbimento — sicché l'assorbività costante in micromolare non è più lo stesso numero in millimolare. Entrambe piegano la curva di taratura verso il basso, ed è per questo che si traccia una retta di calibrazione sull'intervallo davvero usato invece di estrapolarla da un solo punto.